sanger测序简介：

       1977年，英国人Fred Sanger 发现，如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。

       不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。

       由此诞生了以Sanger命名的测序原理即双脱氧链终止法测序原理。

 

 

sanger测序原理：

 

1-用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。
2-每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
3-由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
4-它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段进行检测。

 

图示如下：

 

 

 

sanger测序流程：

 

1-准备模板：质粒、PCR产物
2- 抽样检查DNA浓度和质量，必要时纯化
3-测序PCR反应
4-纯化测序产物
5-变性
6-上机电泳
7-分析数据

sanger测序应用：

1-基因组DNA测序
2-cDNA测序
3-未知序列测序
4-已知序列再测序
5-质粒、PCR产物
6-BAC、YAC
7-细菌基因组DNA
8-法医：线粒体DNA测序

sanger测序分析（带着问题分析）：

1-结合问题
特征：一开始就是双峰，在某一点终止或从头到尾双峰

原因：
a 非单条引物或非单个模板
b 引物在模板上有两个或两个以上结合位点

典型峰图：

 

 

2-杂合问题
特征：峰图中某些位置双峰
原因：a 插入或缺失
b 两套模板，大小相近-从杂合点处出现套峰

典型峰图：

 

 

特征：从碱基缺失位置出现移码，底峰序列表现为主峰向左或向右移动后的序列

 

 

3-非单克隆
特征：插入位点后出现双峰
原因：挑菌未挑到单一菌落

典型峰图：

 

 

4-重复序列
特征：单碱基或两个以上碱基重复出现，导致后续峰图可能移码或乱峰
原因：单个或多个碱基的重复，测序酶会在重复区域有滑动，造成重复后面的序列中断或移码

典型峰图：

 

 

5-移码问题
特征：序列一开始就出现移码现象
原因：
a 引物不纯或降解
b 紧邻测序引物后有重复序列或碱基缺失插入，造成测序一开始就会出现移码现象

典型峰图：

 

 

6-GC含量高
特征：序列局部碱基GC富集，之后可能信号衰减/骤减，峰图变乱。
原因：在测序反应时变性困难

典型峰图：

 

 

7-结构问题
特征：信号衰减或中断，峰图变乱
原因：模板自身的二级结构或高级结构造成的

典型峰图：

 

 

 

文章转自：安徽华晓基因