N Wang, Zhao Z , Gao J , et al. Rapid and Visual Identification of Chlorophyllum molybdites With Loop-Mediated Isothermal Amplification Method[J]. Frontiers in Microbiology, 2021, 12:638315.
蘑菇作为一种较大的真菌在全球范围内分布广泛，具有很高的营养价值和药用功效。据统计，目前世界上有超过14,000种蘑菇，而在我国已知有3,800种，其中约有480种是有毒蘑菇。不少有毒蘑菇具有与可食蘑菇相似的形态特征，难以用肉眼分辨。在我国每年有许多食物中毒事件是由误食有毒蘑菇引起的。其中，大青褶伞（Chlorophyllum molybdites）是一种易被误食的有毒蘑菇之一。大青褶伞在我国不同地区一年四季均有分布，是离人群最近的毒蘑菇种类。仅2019年我国就发生了55起因误食大青褶伞而引起的蘑菇中毒事件，涉及至少133名患者。
蘑菇中毒已成为我国亟需解决的食品安全问题之一。对于不同种类的有毒蘑菇，它们含有多种毒素，可导致不同的中毒症状。摄入大青褶伞主要导致严重的胃肠不适，可持续1-6小时。如果无法得到及时治疗，将造成多器官功能的衰竭甚至危及生命。当蘑菇中毒事件发生时，需要有效，简单且快速的检测方法以进行准确的临床治疗或法医分析。在由有毒蘑菇引起的食物中毒事件中，蘑菇样品经煮熟和消化后会失去其原始形态特征，因此无法通过形态学方法对其完成鉴定。目前已开发多种蘑菇物种鉴定技术，其中基于DNA的分子生物学技术是使用最广泛的方法。作为生物遗传物质的基础，核酸不受年龄，季节，发育阶段和环境因素的影响，且具有很高的热稳定性，不受加工方式的干扰。随着PCR技术的发展已衍生了多种检测方法，如实时荧光PCR、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）和DNA条形码技术等。但是这些方法需要依赖昂贵的仪器设备并相对耗费时间，无法应用于现场快速检测中。建立简单、有效、准确、灵敏的蘑菇菌种鉴定方法有助于中毒发生初期的及时对症治疗。
近年来，等温扩增方法已广泛应用于病原真菌的物种鉴定。其中，LAMP技术的应用最为广泛，已受到越来越多的关注。LAMP反应可在恒定温度（60–65℃）下进行，一小时内指数型扩增（109-1010倍）目的基因，反应结果可直接通过肉眼在日光下观察颜色变化得出。经过十余年的发展，LAMP已广泛用于致病微生物快速检测、临床疾病诊断和食品卫生检查等领域。在蘑菇菌种鉴定方面，目前没有针对大青褶伞物种鉴定的方法发表。
本研究首次将LMAP技术引入大青褶伞的物种检测中，建立了以内转录间隔区（ITS）为靶标的LAMP可视化检测方法。首先设计了大青褶伞LAMP特异性引物组，分析其特异性和灵敏度；考虑到方法的适用性，同时模拟了对经加工和人体消化后蘑菇产物的检测。本发明建立的大青褶伞LAMP检测方法对于蘑菇中毒的预防、快速检测中毒事件中的有毒蘑菇、以及中毒后的针对性治疗和诊断具有重要意义。
图1 大青褶伞LAMP引物特异性分析
注：1：大青褶伞（Chlorophyllum molybdites）；2：近裸裸脚伞（Gymnopus subnudus）；3：黏盖乳牛肝菌（Suillus bovinus）；4：栎裸菇（Gymnopus dryophilus）；5：红褐斑褶菇（Panaeolus subbalteatus）；6：红盖白环菇（Leucoagaricus rubrotinctus）；7：长柄大环柄菇（Macrolepiota dolichaula）；8：白色假根杯伞（Rhizocybe alba）；9：橙黄蜡蘑（Laccaria aurantia）；10：灰褶鹅膏（Amanita griseofolia）；11：近短柄乳菇（Lactarius subbrevipes）；12：蓝黄红菇多变变种（Russula variata）；13：点柄黄红菇（Russula senecis）；14：红黄鹅膏菌（Amanita hemibapha）；15：丽江牛肝菌（Boletus kauffmanii）；16：新苦粉孢牛肝菌（Tylopilus neofelleus）；17：脱皮马勃（Lasiosphaera fenzlii）；18：玫瑰红菇（Lasiosphaera fenzlii）；19：Butyriboletus yicibus；20：细裂皮红菇（Russula velenovskyi）；21：蓝肉齿菌（Hydnellum caeruleum）；22：皂味口蘑（Tricholoma saponaceum）；23：混杂丝盖伞（Inocybe mixtilis）；24：环纹亚齿菌（Hydnellum concrescens）；25：角鳞灰鹅膏菌（Amanita spissacea）；26：鳞盖口蘑（Tricholoma imbricatum）；27：杏鲍菇（Pleurotus eryngii）；28：金针菇（Flammulina filiformis）；29：香菇（Flammulina filiformis）；30：海鲜菇（Hypsizygus marmoreus）；31：Tricholoma olivaceoluteolum；32：Amanita citrinoannulata；33：黄斑绿菇（Russula crustose）；34：大毒粘滑菇（Russula crustose）；35：小豹斑鹅膏菌（Amanita parvipantherina）；36：淡褐口蘑（Tricholoma albobrunneum）；37：疣托鹅膏菌（Amanita verrucosivolva）；38：松口蘑（Tricholoma matsutake）；39：暗盖淡鳞鹅膏菌（Amanita sepiacea）；40：环鳞鹅膏菌（Amanita concentrica）；41：侧耳（Pleurotus ostreatus）；42：裂丝盖伞（inocybe rimosa）；43：假灰托鹅膏菌（Amanita pseudovaginata）；44：血红菇（Russula sanguinea）；0：ddH2O
图2 大青褶伞LAMP引物灵敏度分析
注：1：50 ng/μL；2：5 ng/μL；3：0.5 ng/μL；4：0.05 ng/μL；5：5 pg/μL；6：0.5 pg/μL；7：0.05 pg/μL；8：5 fg/μL；9：0.5 fg/μL；10：0.05 fg/μL；0：ddH2O
（A）
（B）
图3 大青褶伞LAMP方法适用性分析
注：（A）水煮大青褶伞样品；（B）水煮后消化的大青褶伞样品
1：大青褶伞；2：50%大青褶伞+50%杏鲍菇；3：10%大青褶伞+90%杏鲍菇；4:1%大青褶伞+99%杏鲍菇；0：ddH2O
